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產品簡介

外顯子僅占人類基因組的2.5%,但包含了基因表達相關的絕大部分信息。該區域的變異與癌癥、單基因遺傳病、部分復雜疾病等密切相關。外顯子捕獲測序僅對外顯子區域的序列進行測序,相對于基因組重測序成本較低,可以用很小的數據量獲得大量有用信息,對研究基因的SNP、InDel等具有很大的優勢。


Aglient SureSelect外顯子捕獲系統 (www.Agilent.com)

我們的優勢

1. 整合已有數據庫的同時,可以發現全新的突變位點;

2. 采用國際權威的外顯子數據分析流程,并有高分文獻支持;

3. 整合最新的注釋數據庫,確保結果的準確性和高驗證率;

4. 針對特定研究對象設計多套完善的備選方案,并推薦最優的一套。



樣本要求

組織樣品

1. 新鮮動物組織干重≥0.5g

2. 新鮮植物組織干重≥1g

3. 新鮮培養細胞數≥8×106

4. 全血(哺乳動物)≥2ml

5. 全血(非哺乳動物)≥0.5ml

6. 福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPE)>10個玻片或50mm2,5-10μm厚的切片10片

DNA樣品

1. 請提供總量≥3μg/樣本,濃度≥50ng/μL的DNA;

2. OD260/280介于1.8-2.0之間;

3. 電泳檢測無明顯RNA污染,基因組條帶清晰、完整,無降解;

4. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封;

5. 樣品保存期間切忌反復凍融;

6. 送樣時請使用干冰運輸。

注:不同樣品之間存在差異,詳情請向烈冰咨詢



實驗流程


1. DNA提取及質控:凝膠電泳質控→Nanodrop質控→Agilent 2200質控;

2. 靶向捕獲:Agilent Sureselect V6外顯子捕獲90分鐘內完成雜交;

3. 引物序列降解:去除引物序列的影響;

4. 文庫構建及質控:PCR擴增;

5. 上機測序:烈冰建議選擇NovaSeq,雙端測序,通量大,堿基精度高,而且成本低,速度快。測序數據量:10Gb。




數據分析流程

結果示例

1、原始數據質量控制
以原始數據為研究對象,采用Fastp軟件對于低質量序列,未檢測序列,接頭序列進行過濾,并對于過濾前后數據的GC比值,堿基質量,長度分布,接頭留存,Duplication比率等指數進行分析。

原始數據質量控制結果

注:左圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基質量值,不同顏色曲線代表不同堿基在每條read上的質量值;右圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基含量比值,不同顏色曲線代表不同位點各堿基含量。



2、DNA基因組比對(DNA Mapping)與質控
采用BWA-mem/Bowtie2等算法將質控后的測序數據比對到基因組上,得到基因組比對的bam文件。并基于bam文件進行信息統計,得到reads在染色體上的分布、基因組比對率信息。

DNA Mapping結果

注:左圖為reads在染色體上的分布情況;右圖為reads與參考基因組序列比對情況



3、DNA基因組比對優化
采用Samtools和GATK tools,對基因組比對的bam文件進行Remove Duplicate和Recalibrate分析,得到每一個樣本優化后的Bam文件。

基因組比對結構優化

注:該圖展示了GATK tools矯正前后的reads堿基質量值



4、體細胞突變分析(SNP Calling)
采用Mutect2等算法,進行突變分析(SNP Calling),得到腫瘤相對于癌旁的體細胞突變結果。

SNP Calling

Jiang et al., Hepatology, 2014

注:IGV確認候選體細胞突變位點圖



5、體細胞突變注釋
采用VEP軟件對突變發生位點所在的基因進行注釋,并對于突變類型以及突變位點在多種數據庫中的記載情況進行展示。

體細胞突變基因注釋及突變類型

Coco S et al., Cancers, 2019

注:上圖為腫瘤組織樣本中的突變基因;下圖為突變類型的突變頻率,橫軸為突變類型,縱軸為特定突變類型的突變頻率



6、突變過濾
采用國際標準的腫瘤體細胞突變過濾策略,對所有的SNP注釋進行突變過濾,得到具有研究意義的SNP位點以及其注釋信息。

SNP/SNV篩選

Jiang et al., Hepatology, 2014

注:該圖展示了腫瘤體細胞SNP/SNV突變的過濾策略



7、突變基因功能分析(GO Analysis)
采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,對于突變基因進行功能分析得到突變基因所顯著性富集的功能條目。

所有差異基因的GO分析結果

注:該圖展示了顯著性富集的前15GO條目,橫坐標表示-log10(P-value),縱坐標表示GO條目名稱。



8、突變基因信號通路分析(Pathway Analysis)
采用KEGG數據庫,對于突變基因進行信號通路分析得到突變基因所顯著性富集的信號通路條目。

Pathway富集性散點圖

注:該圖展示了顯著性富集的20Pathway條目。橫坐標表示pathway對應的Rich factor,縱坐標表示pathway注釋信息,點的顏色表示P-value的大小,點的大小表示pathway包含的差異基因數量。



高級數據分析
1、構建系統發育樹
選取多個物種的同源蛋白,構建系統發育樹,進一步直觀了解該蛋白基因在不同物種中的保守情況及進化史。

系統發育樹

Jiang et al., Hepatology, 2014

注:該系統發育樹表示含有HECT結構域的旁系同源物。scale bar表示每個位點氨基酸變化數,每個節點處的數值表示相應的bootstrap value。



2、構建蛋白質模型
在蛋白活性中心或者修飾位點發生的突變往往會極大的影響蛋白的功能,因此通過蛋白質的3D模式圖可找到位于蛋白活性中心的突變。

蛋白質模型

Jiang et al., Hepatology, 2014

注:采用生物信息學手段模擬蛋白質的結構并建立了模型,分析顯示Glu959突變位于HECT domain表面的α螺旋上,可能和蛋白活性位點有關。



3、進化分析
將目的基因與其他物種以及本物種的同源基因進行氨基酸保守性預測,觀察發生突變的位點是否為保守的氨基酸位點,如果保守,則該位點的突變可能會影響蛋白功能。

進化分析

Jiang et al., Hepatology, 2014

注:該圖展示了來自不同物種的UBE3Cparalogs的多重序列比對結果。其中,UBE3C中的突變位點用紅色箭頭標記。


文獻示例

[1] Xu LX, He MH, Dai ZH, et al. Genomic and transcriptional heterogeneity of multifocal hepatocellular carcinoma. Ann Oncol. 2019 Mar 27. pii: mdz103. (IF=13.926)


[2] Ricciuti B, Kravets S, Dahlberg SE, et al. Use of targeted next generation sequencing to characterize tumor mutational burden and efficacy of immune checkpoint inhibition in small cell lung cancer. J Immunother Cancer. 2019. (IF=8.374)


[3] Coco S, Bonfiglio S, Cittaro D, et al. Integrated Somatic and Germline Whole-Exome Sequencing Analysis in Women with Lung Cancer after a Previous Breast Cancer. Cancers (Basel). 2019 Mar 28;11(4). pii: E441. (IF=5.326)


[4] Cho SY, Chae J, Na D, et al. Unstable Genome and Transcriptome Dynamics during Tumor Metastasis Contribute to Therapeutic Heterogeneity in Colorectal Cancers. Clin Cancer Res. 2019 Jan 22. (IF=10.199)


[5] Jiang J, et al. Clinical Significance of the Ubiquitin Ligase UBE3C in Hepatocellular Carcinoma Revealed by Exome Sequencing. Hepatology. 2014 Jun;59(6):2216-27. (IF=14.079)

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