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產品簡介

ChIP-Seq是將染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)與二代測序相結合的表觀遺傳研究技術,能夠高效地在全基因組范圍內對DNA和蛋白的相互作用進行檢測,通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。

ChIP-seq Assay Kit for Histone Methylation(Laboratorytalk,2016)

我們的優勢

1. 定制化分析策略:根據不同測序方案和測序目標,定制化選擇比對算法、Peak Calling算法以及注釋用數據庫區域信息;

2. 強大的自研能力:擁有已發表的自主開發Peak Calling算法(Wang et al., BMC Bioinformatics, 2010)和定位注釋系統以及一系列下游分析工具;

3. 全面的數據庫整合:不斷更新基因組數據庫并進行多數據庫多版本整合,獲得最準確的Peak定位信息與注釋;

4. 強大的組學聯合分析能力:將ChIP-Seq與甲基化測序、轉錄組測序以及全基因組測序等技術進行結合,將單一的蛋白結合數據更進一步拓展。


樣本要求

注:前期免疫共沉淀(ChIP)實驗需客戶自主完成,烈冰提供測序和數據分析服務。

ChIP DNA樣品要求:

1. DNA總量≥20ng,濃度≥1ng/μL(Qubit檢測),體積要求20-100μL;

2. OD260/280介于1.8-2.0之間;

3. Agilent 2200質檢合格,DNA樣本主峰范圍在100-500bp;

4. 電泳檢測無明顯RNA污染,基因組條帶清晰、完整,無降解;

5. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封;

6. 樣品保存期間切忌反復凍融;

7. 送樣時請使用干冰運輸。



實驗流程


1. 細胞交聯固定:甲醛處理細胞,將目標蛋白與染色質連結起來;

2. DNA超聲打斷:將基因組DNA打斷至100-500bp;

3. 免疫共沉淀:添加與目標蛋白特異性結合的抗體,形成免疫沉淀復合物;

4. DNA片段回收:去交聯,純化DNA;

5. 文庫構建:PCR擴增構建文庫;

6. 上機測序:烈冰建議使用Hiseq或NovaSeq測序平臺,數據量6Gb。



數據分析流程

結果示例

1、原始數據質量控制
采用Fastp軟件對下機原始數據中低質量序列,未檢測序列,接頭序列進行過濾,并對于過濾前后數據的GC比值,堿基質量,長度分布,接頭留存,Duplication比率等指數進行分析。圖1中部分展示了raw data質控結果。

堿基質量結果圖

注:左圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基質量值,不同顏色曲線代表不同堿基在每條read上的質量值;右圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基含量比值,不同顏色曲線代表不同位點各堿基含量。



2、DNA基因組比對(DNA Mapping)
采用Bowtie2算法將過濾后的數據比對到基因組上,得到基因組比對的bam文件,并基于bam文件進行信息統計,得到基因組比對率、reads在染色體上的分布情況。

DNA mapping結果圖

注:左圖為reads在基因組上的比對情況;右圖為reads在染色體上的分布情況,灰色柱子表示每條染色體上堿基數占基因組的比例,綠色柱子表示比對到染色體上reads的堿基數占基因組的比例。



3、Peak Calling和Peak注釋(Peak Annotation)
采用MACS2算法對DNA Mapping后的bam文件進行peak峰的檢測,得到ChIP樣本中轉錄因子結合或組蛋白修飾的富集區域,即peak區域。并采用Chipseeker算法對peak進行注釋,得到peak對應的基因以及所在的基因結構,包括啟動子、外顯子、內含子、基因間區等。此外,我們還可以采用deeptools軟件對目標區域內測序序列的覆蓋情況進行繪圖,得到reads在peak區域或基因結構上的分布情況。

peak數量及其在基因結構上的分布情況

Twohig JP et al., Nat Immunol, 2019

注:左圖為不同分組peak在基因組結構上的占比情況,右圖為不同分組peak的總數量。



4、Motif分析(Motif Analysis)
采用HOMER/MEME算法以及JAPSAR數據庫,對peak區域進行motif分析,得到潛在的motif特征序列。

特定轉錄因子結合motifs的富集情況

Twohig JP et al., Nat Immunol, 2019

注:MEME與STAMP/Jaspar軟件共同對STAT1和STAT3預測出來的binding Motif。



5、功能分析(GO Analysis)信號通路分析(Pathway Analysis)
分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據庫對Peak Annotation的相關基因進行功能分析和信號通路分析,得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

GO分析結果

Zhang QT et al., Theranostics. 2019

注:左圖為下調基因所顯著富集的GO條目(Top 10),右圖為上調基因所顯著富集的GO條目(Top 10)。



高級數據分析
1、IGV截圖
采用igvtools算法將基因組比對后bam文件轉換為tdf格式,通過IGV軟件對目標基因附近的peak分布情況進行可視化展示。

ISL1靶基因peak分布情況

Zhang QT et al., Theranostics. 2019

注:該圖展示了ISL1靶基因附近H3K4me1H3K27ac和ISL1peak分布情況,箭頭表示結合的peak。



2、基因間相互作用關系網絡(Gene-Act-Network Analysis)
以顯著性GO Analysis和顯著性Pathway Analysis的和組蛋白相關的表型基因為研究目標,采用KEGG數據庫基因間關系注釋,繪制Gene-Act-Network。

基因間相互作用關系網絡

Gao et al., Cancer. 2015

注:Profile12、4基因集間基因互作網絡圖。



文獻示例

[1] Twohig JP, Cardus Figueras A, Andrews R, et al. Activation of na?ve CD4+ T cells re-tunes STAT1 signaling to deliver unique cytokine responses in memory CD4+ T cells. Nat Immunol. 2019 Apr;20(4):458-470. (IF=21.809)


[2] Mirtschink P, Bischof C, Pham MD, et al. Inhibition of the HIF1α-Induced Cardiospecific HERNA1 eRNA Protects from Heart Disease. Circulation. 2019 Mar 29. (IF=18.88)


[3] Han X, Huang H, Gao P, et al. E-protein regulatory network links TCR signaling to effector Treg cell differentiation. PNAS. 2019 Feb 15. pii: 201800494. (IF=9.504)


[4] Zhang QT, Zhang QQ, Jiang X, et al. Collaborative ISL1/GATA3 interaction in controlling neuroblastoma oncogenic pathways overlapping with but distinct from MYCN.Theranostics. 2019; 9(4): 986–1000. (IF=8.537)


[5] Ranjit M, Hirano M, Aoki K , et al. Aberrant Active cis-Regulatory Elements Associated with Downregulation of RET Finger Protein Overcome Chemoresistance in Glioblastoma. Cell Rep. 2019 Feb 26;26(9):2274-2281.e5. (IF=8.032)


[6] Gao Y, et al. Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced offtarget effects. Genome Biol. 2017 Feb 1;18(1):13. (IF=9.202)



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