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單細胞(single cell)取樣問題多?單細胞分離技術講解

時間:2018-07-30    |    閱讀量:1331

大家好!又見面啦!我是你們的烈小冰,今天給大家帶來一篇干貨中的干貨,講講單細胞測序中至關重要的一步——單細胞的分離。


上次跟大家聊的細胞消化懸浮方案反響不錯,各位老師都比較認可,銷售部同事訂單增加不少,BOSS也給加了雞腿。今天烈小冰再次請到了平時神龍見首不見尾的烈冰實驗團隊ACE Mr.Wang跟大家再深入地多聊一些實驗技術的具體操作問題。

上一回我們按照研究方向進行了分類和舉例,今天我們更細致一點,Mr.Wang以親自上手做過的一些樣品為例,按照不同組織/細胞類型進行實驗技巧分享。


1. 肝臟:研究領域為肝癌、肝炎及消化性肝臟疾病,代表性物種為人、大/小鼠等。

肝臟可能是目前單細胞測序領域的一個重要分支,畢竟我國乙肝、丙肝及相應肝癌的患者數量確實太多了。無論是SCI文章還是中文核心期刊文章,大多數protocol都是很相似的,100-200 IU/mlII型膠原酶,剪碎成小塊(1-2 mm3),37℃水浴消化30 min-4 h。根據自己實測的人肝癌和小鼠肝臟樣品結果來看,肝組織都很大,20 min的消化時間,就能拿到足夠多的單細胞了,畢竟細胞數量能夠達到10^5級別即可(What!不是說上機1萬個細胞么?不要著急,后文在注意事項中會解釋具體原因)。Moreover,也有一些課題組應用II+IV型膠原酶的混合液對肝臟組織進行兩次灌注:i)第一次灌注,37℃預熱的D-hanks`液,從門靜脈進入沖洗肝組織內部的血液;ii)第二次灌注,II+IV型膠原酶,門靜脈進入,通過流動的消化液逐步“侵蝕”肝臟內部血管內皮以及肝細胞之間的細胞連接,使組織塊松散。后續使用組織剪和鑷子進行物理撕裂分離,過70 um細胞篩。需要注意的是,整個灌注過程需要高壓注射泵來保持恒定的速度,而且,本方法一般適用于動物原代肝細胞的分離,對于已經切除的肝癌組織,灌注法不太適用。

注意!紅細胞裂解液!紅細胞裂解液!紅細胞裂解液!請實驗人員務必提前準備好新買的、質量好的紅細胞裂解液!鑒于肝臟的解剖學和功能特性,其內部含有大量的血液;而紅細胞對測序結果有一定影響,裂紅這一部分必不可少。因此,要注意的是裂紅試劑最好新買,根據離心后細胞團中紅色細胞的含量/比例盡量一次處理完畢,不要裂紅兩次(細胞活性影響大),裂紅時間能短就不要長(一般不超過5 min)。信了說明書的邪,37℃裂紅5 min,操作2次,細胞活性下降很多。


2. 脾臟:研究領域為免疫相關研究,代表性物種為大/小鼠。

脾臟作為最大的外周免疫器官,其內部含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞,是進行病原感染及基礎免疫學研究最常用的器官,也是我最喜歡的組織之二(另一個是腎臟)。操作方面滿滿的優點,無論是剪碎后IV型膠原酶的消化(仍然是100-200 IU/ml37℃,20-30 min),還是直接暴力研磨,都能拿到很多很好的單細胞懸液。用東北話講,抗霍霍。提醒一點,把脾臟離體后,立刻用銅網研磨,邊研磨邊加入完全RPMI-1640培養液(10% FBS),保證研磨過程中,單細胞會及時被培養液沖洗過銅網,而細胞團塊以及一些成纖維細胞、血管內皮等不能通過銅網,銅網直徑一般是50-70 um,請自行換算成目數。

3. 腎臟:研究領域為內分泌、外周免疫損傷、腎炎等,代表性物種為人、大/小鼠病例模型。

由于腎臟外存在一層相對致密的膜,且解剖學結構很復雜(內部有皮質髓質腎盂腎盞,外部還有一些腺體),制備單細胞懸液的時候,務必要用手術剪或者刀片把組織切得很碎,這樣后續消化得到的細胞中,對應各解剖結構的細胞類型才足夠豐富。當然,也跟一些老師交流過,初步剪碎后,通過暴力研磨也可以拿到足夠好的細胞(也很抗霍霍),后續可以試試。我們親測的結果,IV型膠原酶常規消化流程,可以拿到10^7級別且活性相當高的單細胞懸液,很高效。

4. 外周血來源的單細胞:研究領域為基礎免疫學、免疫相關疾病、內分泌相關疾病等,代表物種為人或者轉基因小鼠。

這部分實驗,需要先區別2個名詞:白細胞和外周血單個核細胞(PBMCs)。血液通過EDTA管子(不能用肝素管!!!)抗凝后,直接裂紅處理,得到的細胞沉淀是白細胞;用淋巴細胞分離液得到的中間云霧層,是PBMCs。主要的差別在于白細胞包含嗜酸/嗜堿/中性粒等細胞,而PBMCs沒有。

隨后,我們可以開始實驗了。無論是直接裂紅,還是密度離心,拿到目的細胞群后,一般都是素質三連(離心---棄上清---洗液重懸),然后計數+計活性,最后混勻稀釋到一定數量后上機鋪板。整個流程是最簡單易行的了。

延伸一些,如果老師們的研究目的細胞群體是某一個亞群的細胞,比如造血干細胞,勢必會用幾種顏色的直標抗體進行FACS分選。這里會衍生出2個實際會遇到的難題:i)目的細胞數量太少,達不到10^5級別;iiFACS分選后,細胞活性也可能不太好。

針對i)數量少的問題,如果原始來源的細胞量足夠,可以通過多批次磁珠富集的方法,收集足夠多的細胞,比如肝臟內部的巨噬細胞(Kupffer細胞)在組織內含量很低,直接分離可能數量太少,建議通過磁珠富集的方法進行。又或者Treg細胞,正常狀態下,僅占PMBSs總量的1%左右。乖乖用磁珠富集了pool在一起再做后續實驗吧。而問題ii),就比較困擾。FACS分選,看似是機器自己操作,但不同的操作人員的操作習慣、實驗手法、以及機器配置對細胞活性都有影響。實在無法避免這一步驟的話,請先做預實驗,摸索穩定的分選條件。另外,有一點是本人還未想通的。FACS分選時,標記抗體越多,拿到的細胞同質性越高,數量也越少;而問題是,單細胞測序,本身就是要測細胞群體的異質性。拿同質性很高的細胞來做異質性分析,理論上是可行的(萬一里面確實有不同的細胞亞群呢,不就發達了么?!CNS不就隨便發了么?!),只不過聽起來乖乖的,而且數量不夠這個問題,一定會影響后續實驗。怎么辦?個人推測,如果目的細胞群體在總細胞中的含量并不是很低的話,其實可以直接拿總細胞群體去做實驗,通過后續的tSNE分析來進行亞群區分以及biomarker分析來確定每一群的marker gene。當然,如果目的細胞亞群數量很少,可能占比10%左右,直接RUN總細胞確實會造成低豐度細胞亞群的細節損失。怎么辦?這時就需要靈活一點,少染幾個染色的抗體,多pool幾個樣本做混池,間接提高目的細胞亞群在總細胞內的相對比例。


請注意,以上推測僅僅是為了實驗能夠順利進行的一些折中方式,可能在后續分析中會有一定的影響,還沒有最終的結論,請勿直接使用。如果造成不必要的損失,也就只能讓烈小冰把BOSS給的雞腿賠給你了。


最后解答一下前面預留的問題:

不是說上機1萬個細胞么?怎么又需要提供10^5級別的細胞?

提供的總細胞量與實際上機細胞量,是兩個概念。老師提供了總細胞,需要經過幾次buffer的素質三連(沉淀—棄上清—重懸),又有可能被裂紅,還要過細胞篩去除細胞團塊。這一系列操作,會丟失大量的細胞(實驗手法的穩定性,在這一步就體現出來了),而且這些丟失無論是用何種平臺都是無法避免的。因此,如果最初老師提供的總細胞量低于10^5這個數量級,一系列操作后可能無法滿足1萬個細胞的上機要求。這時候就只有兩個選擇:i)直接上機,硬做;ii)通過sample label抗體和其他樣品進行pool樣混合上機,最后通過數據分析來區分(套路等同于NGS的樣品間INDEX)。


好了,今天的單細胞分離實驗技術分享就到這里,烈小冰去吃雞腿了,非常感謝Mr.Wang誠意滿滿的實戰經驗分享,我們下期再見


烈小冰受同事之托,對前幾日為烈冰上門做實驗的人員提供包宿的同學表達感謝,跟烈冰一起犧牲休息時間完成單細胞實驗真的辛苦了!也非常感謝對烈冰的信任,將重要的項目托付給我們,烈冰定不會讓你們失望!







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